CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白9）核酸酶表達(dá)載體屬于幾種新興的基因組編輯工具之一（另外兩種是ZFN和TALEN），可在基因組的靶位點快速有效地產(chǎn)生突變。這些質(zhì)粒載體編碼的特異性RNA，能夠引導(dǎo)DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點的DNA序列。

Cas9是RNA引導(dǎo)DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌產(chǎn)生對質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過與基因組中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。 

使用CRISPR打靶目的基因需要目標(biāo)細(xì)胞同時表達(dá)Cas9和特異gRNA。這可以通過在同一個載體上共表達(dá)Cas9和gRNA，也可以通過在兩個載體各上自表達(dá)Cas9和gRNA來實現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個載體分開表達(dá)的優(yōu)勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如野生型Cas9，Cas9n，dCas9），從而根據(jù)實驗?zāi)康膸砀嘧兊膶嶒灧桨浮?/p>

Cas9表達(dá)腺病毒載體系統(tǒng)可以有效地在多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)Cas9蛋白，但是其載體為游離形式存在于細(xì)胞中，不整合宿主基因組。腺病毒常用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及基因治療和疫苗研究領(lǐng)域。

Cas9表達(dá)腺病毒載體首先以質(zhì)粒的方式構(gòu)建并使用E. coli擴增，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)入包裝細(xì)胞。在包裝過程中，位于兩個反向重復(fù)序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細(xì)胞表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成病毒顆粒。當(dāng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時，載體并以游離DNA的形式存在于細(xì)胞核中。兩個ITR區(qū)域之間的Cas9基因和其他病毒基因組分由此進(jìn)入了細(xì)胞。

通過改造優(yōu)化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區(qū)，前兩者與病毒包裝相關(guān)（這兩個基因已被整合到包裝細(xì)胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體包裝出來的病毒是復(fù)制缺陷型的（只能轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞而不能自我復(fù)制），大大提高了生物安全性。

我們提供多種版本的來源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，bao'hanD10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域后，如dCas9/KRAB，可分別應(yīng)用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯開，形成粘性末端）。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

我們的Cas9表達(dá)腺病毒載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng)優(yōu)化，該載體系統(tǒng)在大腸桿菌體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，包裝的活病毒具有很高的滴度，對大多數(shù)宿主細(xì)胞具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，能有效地把載體整合到靶細(xì)胞基因組并實現(xiàn)外源基因的高水平表達(dá)。Cas9表達(dá)腺病毒載體可實現(xiàn)用戶自定義啟動子驅(qū)動下的高水平Cas9表達(dá)。我們可提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實驗需求。

靈活性：單Cas9表達(dá)載體可以與多個不同的gRNA共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞打靶多個位點。此外，單Cas9表達(dá)載體可以通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。經(jīng)FACS或抗生素篩選后，Cas9高水平表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可被用來接受gRNA轉(zhuǎn)染從而獲得高效的打靶率。

對宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，腺病毒載體在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險，使其成為人類體內(nèi)實驗的理想載體。

超高病毒滴度：腺病毒可通過再次轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞而得到大量擴增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和AAV載體都不具有這個特性。我們提供的腺病毒滴度可以達(dá)到>10¹² VP/ml。

宿主范圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細(xì)胞都能被腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，但某些細(xì)胞類型則比較難轉(zhuǎn)導(dǎo)（見下文不足之處）。

體內(nèi)外實驗均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動物實驗，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

安全性：為了確保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必須的基因（這些基因被整合到包裝細(xì)胞的基因組）。 所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒是復(fù)制缺陷型的，并且只有在包裝細(xì)胞中才具有復(fù)制能力。

載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會整合到靶細(xì)胞的基因組中，而是以游離DNA的形式存在，并且隨著時間推移逐漸丟失，特別是在分裂細(xì)胞中。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細(xì)胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多類型的細(xì)胞包括非分裂細(xì)胞，但對某些特定類型的細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、呼吸上皮分化細(xì)胞、外周血細(xì)胞、神經(jīng)元和造血干細(xì)胞等，卻無法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

較強的免疫原性：活腺病毒會在動物體內(nèi)引起強烈的免疫反應(yīng)，從而限制了其在體內(nèi)的某些應(yīng)用。

技術(shù)復(fù)雜：使用腺病毒載體時，需要在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生活病毒，然后測定病毒滴度。因此腺病毒轉(zhuǎn)染相對于常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，技術(shù)難度更高，周期更長。通過選擇我們xia病毒包裝服務(wù)可以有效縮短包裝周期。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點時對gRNA識別序列3'端的PAM序列有嚴(yán)格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus. 

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.